技术文章

6.1 简介

DNA 分析是继免疫荧光之后，流式细胞术的第二个最重要的应用。通过测量单个细胞的 DNA 含量，我们获得了有关其倍性的信息（参见第 6.3 节），与肿瘤特别相关，以及对于一个群体，细胞在整个细胞周期中的分布。DNA直方图与细胞周期的关系 如图6.1所示。该图没有显示 G0 中的细胞（周期外），其 DNA 含量与 G1 中的细胞相同。

图 6.1。 细胞周期与 DNA 直方图的关系。

6.2 染色细胞

为了测量 DNA 含量，细胞必须用与 DNA 结合的荧光染料染色，以准确反映 DNA 的存在量。幸运的是，有几种合适的化合物可用。这些染料在水溶液中仅发出微弱的荧光，但由于其环境的疏水性，当与 DNA 结合时发出强烈的荧光。常用染料列于 表 3.2  （第 3 章 第 3.3.3 节）。

最广泛使用的染料是碘化丙啶 (PI)，它具有红色荧光，可在 488 nm 处激发。PI有两个缺点；它会染色所有双链核酸，因此必须将细胞与 RNase 一起孵育以去除任何双链 RNA，并且染料被质膜排除在外，因此细胞必须在添加染料之前进行固定或透化。可在 Ormerod (2000) 和 Darzynkiewicz 等人中找到适用于 PI 的协议。(1994)。最简单的方法是将细胞固定在 70% 乙醇中。另一种方法是通过将细胞悬浮在含有去污剂的缓冲液中来使细胞去核（Vindelov，1983；Petersen 等人。, 1985)。蛋白质和 DNA 的联合测量方法在第 6.7.2 节中讨论。图 6.2显示了使用 PI 从临床样本中获得的典型 DNA 直方图 。正常二倍体细胞的基质群通常不循环。 

图 6.2。 来自乳腺癌细针抽吸物的 DNA 直方图。将抽吸物离心并将细胞重新悬浮在含有去污剂（以释放细胞核）、PI和RNase的缓冲液中。有正常的二倍体细胞与非整倍体肿瘤一起存在。

如果有紫外或紫激光可用，DAPI 也需要透化，但具有 DNA 特异性，能够提供高质量的直方图。要在没有透化的情况下观察活细胞中的 DNA 直方图，可以使用 DRAQ5（一种 Vybrant DyeCycle 化合物或双苯并咪唑 Hoechst 33342）。后者需要紫外激光进行激发。对于每种类型的细胞，都需要进行初步实验来确定正确的孵育时间和染料浓度，以获得令人满意的 DNA 直方图。

通常通过从常规处理（即福尔马林固定、石蜡包埋）组织中提取细胞核来研究临床标本。从组织块上切下 50 µm 厚的切片，除去石蜡，用胃蛋白酶处理提取细胞核（Hedley 等人，1983）。获得的直方图的质量可能非常好，这取决于最初处理组织的方式。通常可以通过在用胃蛋白酶处理之前将组织切片在 80°C 下孵育来改善（Leers 等人，1999）。图 6.11是从福尔马林固定材料中获得的 DNA 直方图示例 。

6.3 倍性

生殖细胞（配子）中的染色体数称为该物种的单倍体数 n，体细胞中的染色体数称为二倍体数 2n。偶尔一些体细胞可能是四倍体（4n）甚至八倍体（8n）。肿瘤中的染色体数量通常大于 2n（超二倍体），有时更少（亚二倍体）。染色体数量异常称为非整倍性，这反映在 DNA 数量的变化上。

当非整倍性被测量为 DNA 含量的变化，而不是染色体数量的变化时，它应该被称为 DNA 非整倍性。肿瘤的 DNA 含量可以表示为 DNA 指数 (DI)，其定义为肿瘤细胞的 DNA 含量与正常二倍体细胞的 DNA 含量之间的比率。

在临床样品中，有时会将鸡或鳟鱼的红细胞添加到样品中作为标记物，以便更容易确定样品的倍性。鸟类和鱼类的红细胞有核，这两个物种的 DNA 含量低于人类细胞。图 6.3显示了一个示例 。

图 6.3。 来自两个乳腺癌的 DNA 直方图。C：鸡红细胞；T：鳟鱼红细胞；D：二倍体细胞： A：非整倍体细胞。还显示了峰的宽度 (CV)。通过 Vindelov 方法 (Vindelov, 1983) 制备并用 PI 染色的细胞。数据由哥本哈根芬森实验室的 Gyda Otteson 和 Ib Christensen 提供。 数据文件

6.4 DNA 直方图的质量

DNA 直方图的质量是根据周期 G1 中细胞的 DNA 峰的宽度来估计的。这是通过跨峰的变异系数 (CV) 测量的，并根据标准偏差 (SD) 计算得出。

CV = 100 x SD/(峰通道)%，其中峰通道是峰的平均通道数。

DNA 直方图中峰的 CV 越小，倍性的测量越准确，对细胞周期不同区室中细胞百分比的估计就越好。必须消除由于仪器未对准而导致的任何不必要的峰展宽。获得低至 1% 的 CV 是可能的，尽管在非整倍体肿瘤和培养细胞中，由于 DNA 含量的异质性，最佳 CV 可能接近 2%（ 见图 6.3）。团块的数量和存在的碎片量也是重要因素。

获得高质量直方图的关键要素是样品制备、仪器校准和数据分析。

样品制备的目的是获得碎片和团块最少的单细胞（或细胞核）。最好的制备将通过制备细胞核来获得， 如图 6.3 所示 ，使用了 Vindelov (1983) 描述的方法。用碘化丙啶染色固定细胞时，必须留出足够的时间让 RNase 去除所有双链 RNA。如果细胞已固定，将它们在 4°C 下放置过夜通常会改善直方图。如果细胞（或细胞核）浓度很高，则应存在足够的染料以维持化学计量结合。

每天应使用已知 CV 的荧光珠检查仪器的性能；这些可以从多家制造商处购买。应记录一组标准条件（激光功率、PMT 电压和增益）的 CV 和峰值通道数。如果这些超出预定限制（例如，2% CV），则应采取措施恢复仪器的性能。

检查流量是否被意外设置得太高。
检查流动池没有部分堵塞。
如果可能（使用传统的细胞分选仪）重新校准仪器。
如果无法重新校准（大多数台式仪器），请联系服务工程师。

流式细胞仪中样品流的任何扰动都会增加 CV，因此细胞或细胞核的浓度应保持较高（在 5x10 ⁵ 和 2x10 ⁶ /ml 之间）和低流速。DNA 直方图应以线性比例显示。

6.5 从分析中排除团块

细胞周期 G1 中粘在一起的两个细胞核或细胞与 G2 中的单个细胞具有相同的 DNA 含量，如果 DNA 直方图要准确反映细胞周期的状态，则应区分两者。在为 DNA 分析而设计的仪器中，激光束被聚焦以产生椭圆形横截面，其宽度接近典型核的直径。当一个粒子穿过光束时，综合荧光将与 DNA 含量成正比；时间上的信号宽度将是粒子宽度和激光束宽度之和。由于流动系统，细胞团块将倾向于沿流动方向排列，并且会比单个细胞发出更宽的信号。图 6.4）。一些仪器设计为显示宽度与面积，另一些则显示峰高与面积。图 6.5 和 6.6显示了这两种分析的示例 。

图 6.4。 荧光核通过激光束时产生的信号。更多解释见正文

图 6.5。 使用信号峰值对区域的显示来选择单个细胞的分析箭头指向来自两个聚集细胞的簇，两者都在 G1 中。用 PI 染色的乙醇固定细胞。在 Coulter Elite 上记录的数据。 数据文件

图 6.6。 使用信号宽度与面积的显示来分析选择单个细胞。用 PI 染色的乙醇固定细胞。BD FACScan 上记录的数据。 数据文件

图 6.5 和 6.6中的区域  已被绘制为包括 DNA 含量低于 G1 的事件和 DNA 含量高于 G2 的事件。这使得能够获得 DNA 直方图的完整图片。在 图 6.6中，有几个 DNA 含量大于二倍体 G2 的单细胞。这些是具有内重复的细胞（即从 G2/M 返回到 G1 而不分裂）。图 6.7显示了这种行为的一个很好的例子，通常在培养细胞中观察到。

图 6.7。 使用相对于面积的信号峰值显示来选择单个细胞的分析。将培养的细胞 (CCRF-CEM) 固定在福尔马林中，然后用甲醇固定并用 PI 染色。请注意，存在二倍体和四倍体种群，并且二倍体 G2 具有与四倍体 G1 相同的 DNA 含量。数据记录在 Coulter FCS500 上，由迈阿密 Beckman Coulter 的 Vincent Shankey 提供。 数据文件

6.6 细胞周期阶段的计算机分析

图 6.8 显示了一些快速循环细胞的 G1、S 和 G2/M 期的叠加 DNA 直方图。通过用 5'-溴脱氧尿苷 (BrdUrd) 对 S 期细胞进行脉冲标记来分析分离相（参见 第 7 章）。可以看出，早期 S 期和 G1 之间以及晚期 S 期和 G2/M 之间存在相当大的重叠，这是由于细胞染色的变异性和仪器变异性导致的分布变宽。分析 DNA 直方图的问题是找到一个模型来可靠地估计重叠程度。

图 6.8。 V79 中国仓鼠细胞用 BrdUrd 脉冲标记，并用抗 BrdUrd-FITC（S 期细胞）和 PI（细胞周期）标记。 
已在 G1、S 和 G2/M 种群上设置了区域，并覆盖了它们的 DNA 直方图。G1 和早期 S 和 G2/M 和晚期 S 阶段之间的重叠用箭头表示。数据由 George Wilson 提供，当时位于英国 Mount Vernon 的 CRC 实验室。 数据文件

Rabinovitch (1994) 和 Ormerod (1994) 总结了用于模拟细胞周期阶段的各种方法。最严格的算法可能是 Dean 和 Jett 的多项式方法。很少有算法会处理每个直方图，尤其是在数据嘈杂或 CV 很大或细胞周期严重扭曲的情况下。生成的数字不应被盲目接受，而应与原始 DNA 直方图结合使用。还应该理解，计算机程序产生的数字只是估计值。

图 6.9 显示了一些 DNA 直方图的计算机分析。分析程序 Cylchred 使用 Watson 的“实用方法”（Watson 等人，1987；Ormerod 等人，1987）。它由作者编写，由卡迪夫的 Terry Hoy 修改和实施。两种常用的商业 DNA 分析软件包是 ModFit（Verity Software）和 Multicycle（Phoenix Flow Systems）。

图 6.9。 来自鼠白血病细胞系 L1210 的细胞在与 Pt 二羧酸盐孵育后的不同时间。细胞固定在 70% 乙醇中；PI染色。

6.7 多参数测量

6.7.1 将光散射与 DNA 分析相结合

有时光散射会揭示额外的信息。特别是，它可以允许分离不同的群体。在 图 6.10中，光散射门已用于将显示正常细胞周期的细胞与 G2 中受阻的细胞分开，这些细胞的大小增加了。

另一个例子显示了从福尔马林固定、石蜡包埋的乳腺癌中提取的细胞核。未封闭的 DNA 直方图显示了二倍体群体和非整倍体肿瘤。在以这种方式制备的乳房样品中，来自正常细胞的细胞核具有较少的侧向散射（Ormerod 等人，1995）。具有较大侧向散射的肿瘤细胞核有两个亚群。对这些进行门控显示肿瘤具有二倍体和非整倍体成分（图 6.11）。

图 6.10。 与 Pt 二羧酸盐孵育 48 小时后的鼠白血病细胞系。光散射将两个细胞群分开；较大的细胞是那些在 G2 中被阻塞的细胞。详情参见文本。细胞固定在 70% 乙醇中；PI染色。 数据文件

图 6.11。 来自乳腺癌的细胞核。光散射已用于分离两个二倍体和一个非整倍体群体。详情参见文本。PI染色。 数据文件

图 6.12。 卵巢癌患者的腹水细胞用 MOv18 抗体染色细胞上的叶酸结合蛋白（用 FITC 标记），固定在多聚甲醛和溶血卵磷脂中，然后用波形蛋白抗体染色（用 PE 标记）。上皮肿瘤细胞是非整倍体，而正常表达波形蛋白的细胞是二倍体。添加 PI 作为 DNA 染色剂。来自莱顿的 WE Corver 的数据。 数据文件

6.7.2 结合免疫荧光和 DNA 染色

将 PI 与用荧光素标记的单一抗体结合不会出现任何问题。如果用荧光素和藻红蛋白 (PE) 标记两种抗体，PE 和 PI 之间的光谱重叠通常可以但不总是得到补偿（ 见图 6.12）。最好使用发射光谱与抗体上的荧光染料重叠最少的 DNA 染料。如果可以使用紫外或紫激光，则可以使用 DAPI，在这种情况下，可以使用蓝色激光的全部颜色。 

如果表面抗原标记与 DRAQ5 或活细胞吸收的其他 DNA 染料之一结合，则不需要固定。但是，使用 PI 或 DAPI 将需要固定，这可能会造成一些困难。需要选择条件以确保获得高质量的 DNA 直方图。甲醇等固定剂很少与表面染色剂相容。 图 6.13显示了在标记表面抗原后通过透化细胞获得的数据。尽管该方法对于细胞表面标记和 DNA 直方图都不是最佳的，但可以测量细胞的倍性。

图 6.13。 使用 Cycloscope 试剂盒标记 B 型急性淋巴细胞白血病。使用 B 细胞抗原混合物 - CD10、19、20 和 22 鉴定 B 细胞；然后添加 PI。肿瘤是非整倍体（DI = 1.09）。数据由 Cytognos SL 的 Pablo Penalosa 提供。 数据文件 

对于细胞内抗原，固定的最佳方法将取决于所研究的抗原。典型的程序包括： 

• 0°C 70% 乙醇固定；- 20°C 无水甲醇固定；

• 在 0°C 下用 1% 多聚甲醛和甲醇固定；

• 在有去污剂的情况下，在冰上用抗体孵育新鲜细胞； 

• 对于核抗原，用强洗涤剂去核，然后固定。 

接下来的三个示例显示了使用针对细胞周期相关蛋白的抗体进行的核染色。第一个（图 6.14A）显示了细胞周期蛋白 A 在整个细胞周期中的分布。细胞周期蛋白在有丝分裂期间被降解。在第二个中（图 6.14B），细胞被染色以寻找针对 p-组蛋白 H3 的抗体，该抗体对有丝分裂细胞具有特异性。在 图 6.15中，细胞进行了细胞周期蛋白 B2 染色，细胞周期蛋白 B2 在 G2 中表达，但在有丝分裂细胞中呈阴性。

图 6.14。 K562 细胞染色 ( A ) 用于细胞周期蛋白 A，( B ) 用于 p-组蛋白 H3 (FITC)。将细胞固定在 1% 福尔马林中，然后用甲醇固定。DNA染色：PI。
数据由迈阿密 Beckman Coulter 的 Vincent Shankey 提供。 数据文件

图 6.15。 人淋巴母细胞系 W1L2 对细胞周期蛋白 B-FITC 进行染色。将细胞固定在 70% 乙醇中。DNA染色：PI。