技术文章

4.1 简介

所有流式细胞仪都有一台与之关联的计算机。计算机程序在数据采集期间控制细胞仪。它用于：
 

•     选择测量参数；

•     在不同的参数上选择面积、宽度或高度（脉冲处理见  第 2.5.2 章）

•     调整 PMT 上的电压；

•     调整放大器的增益设置；

•     选择对数或线性放大

•     选择和调整阈值（鉴别器）设置（见 第 2.5.1 章）；

•     调整颜色补偿的设置（参见 第 5.2 章）

•     选择直方图和细胞图进行显示；

•     绘制区域并设置要在数据采集期间使用的门（见下文）。

如果流式细胞仪可以分选细胞，则计算机控制分选过程。

在获取数据时，它们会写入硬盘驱动器以创建数据文件，通常称为“列出的数据”。然后，计算机程序可用于分析采集后的数据；离线分析对于为出版物、演讲幻灯片等准备插图很有用。

有一个程序可以方便地分析其他位置计算机上的数据文件。为此目的提供了多种程序；其中一些是商业销售的，另一些是免费的。无论使用什么程序，数据分析的原理都是一样的。

4.2 光散射

大多数仪器测量与激光束成直角的细胞散射光（侧向散射，SS）和向前散射的光（前向散射，FS）（参见 第 2.3.1 章）。散射的光量受细胞（或被测量的其他粒子）的大小、形状和光学均匀性的影响。它还取决于测量散射的角度。特别是，FS 对收集光的角度范围很敏感。因此，FS 的外观将取决于仪器设计，并且在不同品牌的细胞仪中可能略有不同。

FS 对细胞的大小最敏感，而 SS 受光学均匀性的影响最大。

4.3 选通数据

要显示来自单个参数的数据，我们可以使用单变量直方图（图 1.1）。我们可以使用双变量直方图或细胞图以点、等高线或密度图的形式显示两个参数之间的相关性（图 1.2）。然而，不可能在多参数数据中可视化相关性，可能由在每个细胞上测量的多达 12 个荧光组成。我们必须采取不同的策略；我们使用所谓的“区域”和“门”。

区域是在一个或两个参数图上围绕感兴趣的人群绘制的形状。当一个区域用于限制在绘图上绘制的单元格时，它被称为门。

图 4.1。 来自人类外周血白细胞的数据。 一个。光散点图；标记为 G、M 和 L 的簇分别来自粒细胞、 
单核细胞和淋巴细胞。 乙。两个荧光图。 数据文件

图 4.1 显示了来自人类外周血白细胞的一些四个参数数据的两个点图。细胞用抗 CD4-FITC 和抗 CD8-PE 标记，这两种蛋白质都在 T 淋巴细胞上表达。光散射（SS 与 FS）定义了三个不同的群体；这些是粒细胞、单核细胞和淋巴细胞，标记为 G、  M 和 L。CD4 与 CD8 的图中至少有四个亚群，但我们无法立即在两个点图中显示的不同群体之间建立联系。

在 图 4.2中，已在光散射细胞图中的淋巴细胞簇周围绘制了一个区域 (R1)。计算机已将该区域中的单元格着色为红色。在从该数据创建的所有其他点图中，落在该区域内的任何单元格也被涂成红色。颜色标识 CD4 与 CD8 图中的淋巴细胞。这种方法有时被称为“颜色门控”。区域 R1 也可用于在 CD4 与 CD8 的细胞图上设置门；也就是说，指示计算机仅显示落在 R1 中的单元格；所有落在 R1 之外的单元格都被忽略。

图 4.2。 如图 4.1。已在淋巴细胞 ( A ) 周围绘制了一个区域 R1。在 B中，淋巴细胞被染成红色，在 C中 ，门已设置为仅显示 R1 中的细胞。 数据文件

可以遵循类似的程序来显示单核细胞的荧光（图 4.3）。图 4.2 和 4.3的比较  表明，单核细胞主要表达 CD4，而淋巴细胞可以表达 CD4 或 CD8，但不能在同一细胞上同时表达。 

图 4.3。 如图 4.1。围绕单核细胞 ( A )绘制了一个区域 R2 。在 B中，单核细胞呈蓝色，在 C中 ，门已设置为仅显示 R2 中的细胞。 数据文件

门可以使用布尔逻辑（AND、OR、NOT）相互组合。最常见的组合是顺序使用门。这相当于：如果一个单元格在（Gate 1 AND Gate 2）中，那么做一些事情。图 4.4显示了一个示例 ，该图显示了用抗 CD20-FITC（一种 B 细胞标记）、CD2-PE（一种 T 细胞标记）和 CD8-ECD（一种细胞毒性 T 细胞的标记）染色的人外周血白细胞数据）。在散点图 ( A ) 上围绕淋巴细胞绘制了一个区域 (Lymphs )。该区域用于在 CD2 与 CD20 荧光 ( B ) 的图上设置门。在 CD2+ve、CD20-ve 细胞上设置另一个区域（T 细胞）。两个区域都用于门控显示 CD2 与 CD8 荧光（C）。显示的细胞位于区域（淋巴）和区域（T 细胞）；所有其他细胞都被排除在外。CD8 +ve、CD2 +ve 细胞用箭头表示。

图 4.4。 用 CD20-FITC、CD2-PE 和 CD8-ECD 染色的人外周血白细胞。更多信息，请参见正文。 数据文件

图 4.5 显示了一个使用非门的示例，它允许从细胞周期的 G1 和 G2/M 分离细胞与 S 期细胞分离。如需进一步讨论，请参阅 第 8 章。

图 4.5。 中国仓鼠 V79 细胞与 BrdUrd 一起孵育 30 分钟。将细胞固定并用抗 BrdUrd 
和碘化丙啶 (PI) 的抗体染色。标记为“S 期”的区域放置在 BrdUrd +ve 细胞 ( A ) 上。面板 B 显示 DNA 直方图。面板 C 显示了不处于 S 期的细胞，产生 G1 和 G2 细胞。数据由底特律的 GD Wilson 提供。 数据文件

4.3.1 后门

通常的做法是使用光散射细胞图上定义的选定群体周围的区域来设置荧光参数显示的门限。但是，有时还不清楚应该在哪里绘制该区域。在这种情况下，通常可以在荧光参数上绘制一个区域，该参数定义了感兴趣的群体，以及用于在光散点图上设置门的区域。现在可以更清楚地看到散射，从而可以设置正确的区域，进而以正常方式用作门。

该过程 如图 4.6 所示。  图 4.6a 显示了一些人卵巢癌细胞中掺入外周血的未门控数据。它们已用卵巢细胞的抗体 Ber-EP4-FITC 进行标记。目前尚不清楚在散点图的何处绘制区域以定义癌细胞。在图 4.6b 中，围绕 Ber-EP4 阳性细胞绘制了一个区域，该区域已用于在光散射图上进行门控（图 C）。该图可用于为上皮细胞的光散射门设置区域。它将包括一些粒细胞，但会排除大部分白细胞。

图 4.6a。人癌细胞加外周血。 一个。散点图（注意侧向散射是对数的）。 乙。侧向散射与 Ber-EP4-FITC。（一些较大的上皮细胞在 FS 轴上超出刻度。事后看来，FS 应该以对数刻度测量）。数据由英国癌症研究所的 Martin Forster 提供。数据文件 

图 4.6b。 详见 图 4.6a。在 图B中，围绕 Ber-EP4 阳性细胞绘制了一个区域。该区域随后被用于在光散点图 ( C ) 上进行选通。白细胞亚群也已根据它们的侧向散射和 Ber-EP4 缺乏表达进行了鉴定。 数据文件

4.4 统计分析

4.4.1 分布的强度和分布

通常由分布、强度和传播两种措施组成。在流式细胞术中，分布的强度可以用分布“中心”的位置来表示。“中心”通常用平均数、中值或峰值通道数在数学上表示。

如果数据以线性刻度显示，则使用算术平均值；对于对数显示的数据，一般选择几何平均数。如果分布的任何部分在轴的任一端超出比例，则平均通道数的值将不准确，不应使用；中位数通道只要按比例分布一半以上即可。峰值通道数是分布中心的不准确度量，不推荐使用。对于高斯（正态）分布，这三个值应该相等。

分布的散布通常表示为标准偏差 (SD)。然而，在流式细胞术中，变异系数 (CV) 是首选，因为它是无量纲的，并且在线性尺度上，不依赖于直方图中记录数据的位置。（CV = SD/平均通道数）。

4.4.2 亚群中的细胞数

通常需要一个亚群中的细胞百分比。在免疫荧光分析中，通常在细胞图上绘制象限并记录每个象限中的细胞数。在图 4.7中，已经设置了一个象限来描绘 CD4 +ve、CD8 +ve 和阴性群体。虽然象限通常使用方便，但并不总是需要 。图 4.8显示了一个更适合多边形区域的示例。

图 4.7。 显示每个亚群中细胞百分比的象限区域。

图 4.8。 神经母细胞瘤细胞与 BrdUrd 一起孵育，并用抗 BrdUrd 抗体和碘化丙啶标记，与 DNA 结合并显示细胞周期。多边形区域已用于定义 +ve 和 -ve 单元格。有关此方法的更多信息，请参阅 第 8 章。

虽然流式细胞仪通常给出特定细胞子集的百分比，但一些流式细胞仪精确记录分析的样品体积或提供固定体积的样品。细胞亚群的百分比计数可以直接转换为绝对计数。在没有此功能的仪器中，有两种方法用于测量绝对计数，称为 两平台 或 单平台 方法。

在双平台方法中，样品中所有细胞的浓度由另一种方法确定。对于血液白细胞，使用血液计数器。对于培养的细胞，可以使用电子尺寸（Coulter）计数器。然后使用流式细胞仪确定特定子集中细胞的百分比，从而可以计算子集中的细胞浓度。双平台法的缺点是两台仪器的误差是复合的，需要两台仪器。在单一平台方法中，在细胞仪上进行绝对细胞计数。一些仪器允许分析固定体积的样品，这将直接给出绝对计数。在大多数细胞仪中，固定体积的样品中加入了已知数量的荧光珠。（可从 Beckman Coulter 获得具有测定浓度的合适珠子；或者，含有已知数量的冻干珠子的试管由 BD 出售）。珠子的亮度和光散射与细胞不同，因此可以在流式细胞仪中轻松区分珠子和细胞。计算所分析样品部分中的珠子数量可以计算分析的体积，从而计算细胞浓度。这种方法的缺点是珠子会相互粘连并粘在管壁上，导致低估了珠子的数量。珠子的亮度和光散射与细胞不同，因此在流式细胞仪中可以轻松区分珠子和细胞。计算所分析样品部分中的珠子数量可以计算分析的体积，从而计算细胞浓度。这种方法的缺点是珠子可以相互粘连并粘在管壁上，导致低估了珠子的数量。珠子的亮度和光散射与细胞不同，因此在流式细胞仪中可以轻松区分珠子和细胞。计算所分析样品部分中的珠子数量可以计算分析的体积，从而计算细胞浓度。这种方法的缺点是珠子可以相互粘连并粘在管壁上，导致低估了珠子的数量。

4.4.3 阳性判定

在记录阳性细胞的百分比时，我们需要区分阴性和阳性染色，即定义阴性群体。要定义阴性细胞，未染色的细胞是不够的；它们只会校正自发荧光，而忽略与细胞非特异性结合产生的任何荧光。

如果样品中含有阴性细胞， 如图 4.4 所示，则样品中内置了对照，通常不需要进一步的对照。如果样本不含阴性细胞，人们通常会使用同种型对照。例如，如果细胞用荧光素标记的小鼠 IGg1 抗体染色，则标记的 IgG1 部分用作对照。这种对照可能是错误的，除非特异性抗体和非特异性对照的荧光与蛋白质的比率相同。对于多色实验，推荐使用“荧光减一”（FMO）（Roederer，2000）。用于简单四色染色的对照示例如 表 4.1所示。

表 4.1。 四色实验中阴性对照所需的样品。

图 4.9 显示了 CD4 的染色。存在其他阴性淋巴细胞；正面和负面的区别很明显；进一步的阴性对照是多余的。

图 4.9。 淋巴细胞上的 CD4；明确区分正负细胞。

图 4.10A。 白血病中的 CD38。正面和负面的区别尚不清楚。 数据文件

在 图 4.10A中，阳性和阴性群体重叠，需要一个阴性对照来估计阳性比例。在这个样本中，使用了同种型对照。有时，使用例如 Overton (1985) 首次描述的方法从阳性样品中减去同种型对照会很有帮助，参见 图 10B。 

图 4.10B。 白血病中的 CD38。与图 10 A 相同的数据，显示了直方图减法的结果。

在 图 4.11所示的数据中，只存在一个群体。有时做法是在阴性对照上放置一个标记，以包括 98% 的细胞，并将阳性样本中任何大于此的染色记录为阳性，这对于 图 4.10中的数据是有效的。在这种情况下，它显然是无效的。所有细胞均为阳性；它是应记录的阳性程度，最好是等效可溶性荧光染料分子 (MESF)（参见 第 5 章第 3 节）。

图 4.11。 Ki-67 在来自细针吸出物的乳腺癌细胞中的表达。标记 M1 覆盖了 98% 的阴性细胞。阳性细胞与同种型对照重叠。 数据文件

4.5 罕见事件的检测

流式细胞仪非常适合检测罕见事件。如果有合适的标记可用于将被分析的细胞与其他事件分开， 则可以测量10 ^{7中少至 1 个细胞。}为了获得所需统计显着性的计数，只有阳性事件的总数 (n) 是相关的。在没有任何背景的情况下，标准偏差 (SD) 将等于 √n。对于 3% 的 CV，需要计数 1000 个阳性细胞。如果存在非特定事件，则此数字会增加。如果从阳性样本中记录“a”事件，从阴性对照中记录“b”，则 SD 为 √(a + b)。增加识别标记的数量通常会改善阳性细胞与大量细胞群的分离并提高测量的精度。

 应用罕见事件分析原理的 应用程序可在 第 7 章第7.3、7.4、7.8和7.12 节中 找到。

另一个应用是检测癌症患者骨髓和外周血中的肿瘤细胞。