技术文章

7.1 简介

流式细胞术在常规临床实验室中越来越多地用于疾病的诊断、预后和监测。下面描述了一些广泛使用的应用，以及对质量控制的一些评论。其他应用，例如 DNA 倍性和细胞周期的测量（第 6 章），以及粒细胞中氧化爆发的测量（第 10 章，第 10.2 节）将在别处找到。除网织红细胞分析外，所有这些应用都涉及使用免疫荧光法测量细胞内或细胞上的蛋白质（第 5 章）。

7.2 白血病和淋巴瘤分析

通过流式细胞术进行免疫表型分析是血液肿瘤患者诊断和分期的重要工具。它与经典形态学结合使用。

在骨髓中，正常血细胞是从干细胞经过一系列渐进性分化发育而成的，然后分叉以产生不同的细胞谱系（例如，骨髓或淋巴样、T 细胞或 B 细胞），每个细胞都有不同的成熟途径. 在每个阶段，细胞都携带一组独特的标记，这些标记按 CD（分化簇）命名法分类。恶性肿瘤可能出现在细胞发育的不同阶段。白血病或淋巴瘤将根据分化的阶段和途径表达一组特定的标志物，并且它们被相应地分类（参见，例如，Qadir et al.. 2006，以及其中的参考文献）。然而，白血病可能缺乏某些标记或表达异常蛋白质。甚至还有双表型白血病。

初步评估是使用一组抗体进行的，通常以三种或更多颜色组合使用它们。选择的小组将取决于最初的临床诊断。初始筛选的结果可能表明需要使用对特定疾病更具体的扩展面板进行进一步分类。基本标记包括：

B细胞：CD5、CD10、CD19、CD20、CD45、Kappa、Lambda； 
T细胞：CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD45、CD56； 
骨髓单核细胞：CD7、CD11b、CD13、CD14、CD15、CD16、CD33、CD34、CD45、CD56、CD117、HLA-DR； 
浆细胞：CD19、CD38、CD45、CD56、CD138。

CD45 由所有白细胞表达，SS 与 CD45 的关系图通常可以很好地估计最重要的白细胞亚型。如果测量四种或更多颜色，习惯上将 CD45 作为一种颜色包含在每个试管中。

已经有几篇关于这个主题的评论文章和共识报告，例如，参见 Craig 和 Foon，2008，以及 Wood 等人。, 2007. 白血病分析示例可在http://wiki.clinicalflow.com找到。

7.3 微小残留病的检测

微小残留病（MRD）被定义为超出常规显微镜形态学检测极限的疾病。当骨髓样本中含有 <5% 的肿瘤细胞时，急性白血病患者被认为处于缓解期。流式细胞术方法可以检测到低得多的疾病，这在白血病的临床管理中可能很重要。使用表面标志物的免疫荧光检测残留的肿瘤细胞。使用一组至少三种抗体，根据原始白血病的免疫表型选择抗体。

图 7.1显示了一个示例 。Campana 和 Coustan-Smith (2004) 以及 Kern 等人。 (2008) 回顾了研究白血病 MRD 的方法。

图 7.1。 来自接受治疗并被认为处于临床和形态学缓解状态的急性淋巴细胞白血病 (ALL) 儿童的骨髓样本。在密度梯度上分离单核细胞，并用与白血病表型相关的三种抗体-CD19/CD34/CD13 进行标记。一个样品用同种型对照代替 CD13 抗体。CD13 与 CD34 图在光散射和 CD19、CD34 +ve 簇上进行门控。记录了 110,000 个事件；在同种型对照上设置的区域内有 62 个细胞，在阳性样品上设置在同一区域内有 2021 个细胞。数据由孟菲斯圣裘德医院的 Dario Campana 提供。 数据文件

关于应该记录的细胞数量和结果的统计意义的评论可以在 第 4 章第 4.5 节中找到。 这些评论也适用于 第7.4、7.8和 7.12节。

7.4 干细胞计数

骨髓中的造血干细胞可以通过其 CD34 的表达来识别。通常，骨髓中此类细胞的数量很少，在外周血中可以忽略不计。然而，如果刺激从骨髓中调动 CD34 阳性细胞，则可以从外周血和骨髓中采集干细胞。这些细胞可用于在例如高剂量化疗后重新填充耗尽的骨髓。

为了帮助识别一小部分 CD34 阳性细胞，使用了 CD34 和 CD45 的双重染色。该方法给出了CD34 +ve 细胞的百分比。为了获得绝对 CD34+ 浓度，在血液分析仪（双平台方法）中计算总细胞浓度。整个过程可以在流式细胞仪（单一平台）上进行，方法是在样品中加入已知数量的荧光珠，这样就可以计算分析的血液体积（Keeney 等人 1998）（参见 第 4章 第4.2.2 )。Gratama等人已经讨论了分析中涉及的问题 。 （1998 年）。

图 7.2。 外周血中CD34 + ve 细胞的计数。使用 CD45-FITC 和 CD34-PE 的免洗方案对细胞进行标记。在分析之前，添加了 7-AAD。将荧光珠添加到未稀释的血液中，每微升有 102 个珠子。数据由加拿大安大略省伦敦健康科学中心的 Mike Keeney 提供。 数据文件

图 7.2 显示了使用遵循 ISHAGE 指南 (Sutherland  et al., 1977)。区域 A 设置在 SS 与 CD45 的细胞图上以描绘白细胞。B区设置为包围CD34 + ve 细胞。包括弱阳性 CD45 细胞的区域 C 设置在 SS 与 CD45 门控 (A 和 B) 的点图上。在 SS 与 CD45 图上的淋巴细胞周围绘制区域 D，并用于门控 SS 与 FS 的图。绘制区域 E 以包括所有淋巴细胞，并将该区域复制到另一个散点图上（A AND B AND C），（E2）。区域 F 绘制在 SS 与 7-AAD 的点图上，以排除 7-AAD 阳性细胞（死细胞）和该区域上所有先前的图。然后将区域E2中的细胞记录为CD34 +ve 细胞。区域 G 在单独的图上围绕单个珠子绘制。记录了 2758 个珠子和 96 个 CD34 +ve 细胞，产生 3.5 个 CD34 +ve 细胞/μl。

有关 CD34 定量的更多示例，请访问www.denovosoftware.com/site/Publishing.shtml。

7.5 实体器官移植

7.5.1 T 细胞交叉匹配

流式细胞术可用于将受体血清与供体淋巴细胞交叉匹配，以检测可能干扰植入的抗体（Bell 等，1998）。在器官移植之前，器官供体的淋巴细胞与来自移植物的潜在受体的血清一起孵育。洗涤后，使用 FITC 偶联的抗人 IgG 抗体检测结合的免疫球蛋白。使用 PE-CD3 偶联物鉴定 T 细胞。

7.5.2 术后监测

器官移植后，外周血淋巴细胞分析可能有助于指示免疫抑制治疗期间的早期排斥和骨髓毒性，并有助于区分感染与移植排斥（Shanahan，1997）。根据临床情况和移植器官，可以使用多种细胞表面标志物和活化抗原。

外周血检测也可用于监测抗排斥免疫抑制疗法的有效性，其中可能包括例如旨在破坏 T 细胞的抗体。循环 T 细胞的数量通常通过测量细胞表面标志物 CD3 来确定。

7.6 自身抗体的检测

白细胞、血小板和红细胞的自身抗体可能存在于多种自身免疫疾病中，可导致贫血、白细胞减少或血小板减少。它们在直接或间接测定中通过免疫荧光检测。前者使用抗人Ig抗体检测患者细胞表面的Ig。在间接测定中，观察患者血清中的抗体与来自正常人的细胞的反应。该程序类似于用于 T 细胞交叉匹配的程序（参见 第 7.5.1 节）。

7.7 HIV 感染。

外周血中 CD4 +ve 淋巴细胞数量的测定用于监测 HIV 感染患者（Mandy 等，2002）。通过对 CD45/CD3/CD4 进行染色，可以在单个试管中获得 CD4 +ve 细胞的百分比。SS 与 CD45 的细胞图用于识别淋巴细胞，CD4 与 CD3 的细胞图用于计数 CD4+ve T 细胞。扩展面板用于获得更完整的外周血淋巴细胞图像。

CD4 +ve 细胞的绝对数量是临床相关参数； 有关计数细胞的讨论，请参见 第 4 章第 4.4.2 节。

最近，人们关注开发一种使用低成本细胞仪的简化方法，该方法适用于发展中国家，特别是那些 HIV 感染高发的非洲国家（Mandy 等，2008）。

7.8 母婴出血

胎儿母体出血可使恒河猴血型 D-ve 母亲对来自胎儿的 D+ve 血细胞敏感。在随后的妊娠中，新生儿的溶血性疾病可能是由于母体抗 D 抗体破坏胎儿的恒河猴 D + ve 血细胞而引起的。在恒河猴 D + ve 孩子分娩后不久给予恒河猴 D + ve 母亲预防性抗 D 显着降低母亲中抗 D 致敏的发生率，并导致如此治疗的母亲的疾病几乎消除。由于给予的抗 D 剂量与母胎出血的大小有关，因此对母胎出血的定量很重要。

通过用 FITC 偶联的非凝集性抗 D 抗体标记母体血液样品中的红细胞来实现定量（Nance 等，1989）。低至 0.1% 的胎儿细胞群足以使父母敏感，因此应分析至少 500,000 个细胞以获得具有统计学意义的估计。

7.9 免疫缺陷疾病

由原发性免疫缺陷引起的疾病，通常见于婴儿和幼儿，可能是 T 细胞、B 细胞、粒细胞或单核细胞缺陷的结果。在许多这些疾病中，表面或细胞质蛋白缺失或功能受损。它们以免疫表型为特征，抗体的选择基于临床表现。

流式细胞术也可用于检测白细胞的功能异常。可能的功能测试包括分析粒细胞和单核细胞中的氧化爆发和吞噬功能（参见 第 10 章， 第 10.2 节）、T 和 B 细胞有丝分裂原反应、NK 细胞肿瘤细胞溶解功能和血小板活化抗原。

继发性免疫缺陷是由另一种疾病、病症、药物治疗或干预引起的，患者经常出现非典型感染。一些可能导致免疫缺陷的病症和疾病包括严重的营养不良、生物素、B12 或锌缺乏、淋巴瘤、重症肌无力、骨髓瘤、放疗或化疗、慢性酒精中毒、药物滥用、癌症、脾切除术和慢性病毒性疾病。如果怀疑继发性免疫缺陷，可以通过分析外周血淋巴细胞来评估免疫状态。标志物组可能包括 CD3、CD4 和 CD8（用于评估 T 细胞）、CD19（用于 B 细胞）、CD56（NK 细胞），以及在与 PHA 等有丝分裂原孵育后，HLA-DR 或 CD69（用于评估淋巴细胞活化）。

7.10 阵发性夜间血红蛋白尿

阵发性睡眠性血红蛋白尿 (PNH) 是一种获得性疾病，其特征是在骨髓中出现异常的前体细胞克隆。产生的白细胞和红细胞功能失调，容易裂解。通常，通过流式细胞术分析这种克隆异常可以通过分析红细胞上的 CD55 和 CD59 来完成（Richards 等，2000）。

7.11 网织红细胞分析

网织红细胞可通过其高含量的 RNA 与红细胞区分开来。有几种染色剂可用于 RNA，其中之一是噻唑橙（Davis 和 Bigelow，1994）。典型结果 如图 7.3所示。

图 7.3。 具有高浓度网织红细胞的外周血红细胞的噻唑染色。在散点图中的红细胞上绘制了一个区域；注意对数刻度。散点图中的另一个主要簇是血小板。直方图在红细胞上进行门控，其上的区域描绘了具有高 (H)、中 (M) 和低 (L) 荧光的细胞，对应于网织红细胞成熟度的增加。N 标记有核红细胞。数据由 Terry Hoy 提供，然后在加的夫威尔士大学医学院工作。 数据文件

7.12 输血中的一些其他应用

有关此主题的评论，请参阅 Garratty 和 Ardnt (1995)、Garratty (1999) 和 Freedman 和 Lazarus (1995)。

7.12.1 污染白细胞

输血产品中存在污染的白细胞可能会导致许多不良反应。这些包括：

• 非溶血性发热反应 
• 移植物抗宿主病 
• 巨细胞病毒传播 
• 肺水肿 
• HLA I 类抗原同种免疫

流式细胞术可以灵敏地测量经过白细胞过滤的产品（如血浆和红细胞）中剩余白细胞的数量。

7.12.2 红细胞 (RBC) 测量

可以对红细胞进行的测量包括：

• RBC 结合蛋白的检测和定量 
• RBC 结合免疫球蛋白的 
定量 • RBC 抗原和抗体的 
检测和定量 • 少量 RBC 群体的检测和定量，包括输注 RBC 的检测和定量以及胎儿 RBC 的检测和定量母体血液中（见 第 7.8 节）。

7.13 血小板计数和功能

流式细胞仪可用于计数血小板，也可用于测量其表面蛋白（Harrison 等人，2001、2005、Michelson，2006）。后者在血小板激活期间发生变化，可用于测量它们的激活状态。血小板很容易被激活，血液必须小心采集和处理；因此，通常首选全血方法。

流式细胞仪分析血小板可应用于

• 识别遗传性疾病 
• 监测抗血小板治疗 
• 监测临床病程 
• 监测血小板减少症中的血小板生成 
• 识别有血栓形成风险的患者 
• 血小板减少症中的准确血小板计数 
• 肝素诱导的血小板减少症的诊断

图 7.4显示了血小板中 CD41 表达的一个例子 。

图 7.4。 人外周血与抗 CD41-FITC 一起孵育，然后按 1:10000 稀释。血小板加红细胞 (RBC) 簇要么是巧合事件，要么是血小板和 rbc 相互粘附。如果样品进一步稀释或流速降低，同时发生的事件数量会减少；聚合将不受影响。数据文件

7.14 质量控制

在临床工作中，质量控制至关重要，每个实验室都应确保其程序为其结果的有效性提供适当水平的保证（Owens 等，2000）。仪器性能的日常检查应按照 第 2章 第 2.8 节的说明进行. 从事日常临床工作的实验室应加入质量控制计划。细胞样本定期从参考中心发出，每个实验室都会记录某些亚群中细胞的百分比（或在某些情况下，例如 HIV，绝对数量）。整理所有实验室的数据，并通知任何数据超出正常范围的实验室。这种质量控制计划通常是在全国范围内组织的。（赖利和巴内特，2001 年）。

7.15 参考文献