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流式细胞仪的基本组成部分 如图 2.1所示。

图 2.1。 流式细胞仪的组成部分

2.1 流动室

流动室位于仪器的中心。这通常被称为流动池，但我使用了“腔室”一词以避免与生物细胞混淆。它旨在在测量点以单个文件的形式提供细胞。样品被注入液体流（水或缓冲液）的中心，称为鞘液。如果流动不受干扰，则鞘液和样品流不会混合，后者会变窄，通常直径约为 10 µm，从而限制细胞移动通过腔室的中心。此时，光线被聚焦（图 2.2）。

图 2.2。 流动室的基本特征。墙壁通常由石英制成。

有两种类型的基本流动室：仅用于分析的全封闭室和样品流进入露天的室，用于分析和分选细胞。前者通常有一个基于石英比色皿的腔室。另一种类型的设计用于基于显微镜的细胞仪，其中荧光是在光路中测量的。顶面通常是盖玻片或等效物。

基于石英比色皿的典型腔室设计 如图 2.3所示。这种设计适用于细胞分选机。在无法对细胞进行分类的台式分析仪中，流动通常是垂直方向以清除任何小气泡。除了护套和样品管线外，还连接了一条真空管线，以方便清洁并清除任何堵塞物。

连接到腔室的收集透镜可最大限度地收集收集的荧光和散射光量。

图 2.3。 典型分析流动室的设计。

图 2.4。 基于显微镜的流动室（Partec）。 

图 2.5。 用于“空气流”系统的流动室。

一些仪器无需鞘液，而是依靠系统几何结构和样品流来聚焦细胞流（例如 Guava Technologies 的 EasyCyte）。

图 2.4显示了基于显微镜的仪器的腔室 。

当细胞被静电分选时，鞘流和样品流会出现在空气中。分拣室有两种类型；一种基于 图 2.3所示的比色皿设计；在另一个中，激光询问室外的细胞（图 2.5）。这种系统通常被称为“空气中的流”或“空气中的喷射”。

更多细节在 第 2.7 节中给出。

2.2 流体学

射流元件 如图 2.6所示。通常，鞘液由压缩机提供的气压驱动通过流动室。相同的压力用于迫使样品进入护套。样品流速由压力调节器调节。这可以是连续可变的或固定为三个设置（高、中和低）。夹管阀控制是否引入样品。一些系统通过注射泵输送样品。

有一个真空系统用于清洁流动室，也用于清洁循环（未显示）。

图 2.6。 流式细胞仪的流体布局。

2.3 光源

光源可以是激光、弧光灯甚至是LED。今天，大多数仪器使用激光。

选择激光器是因为它们产生高强度的单色光束。它们还具有较小的“光斑”尺寸，这一点很重要，因为需要将光聚焦到一个小体积中以获得单个细胞的最大激发，并最大限度地减少激光束中存在多个细胞的可能性。

弧光灯需要滤光片来选择合适的波长。它们不提供观察弱荧光所需的灵敏度，但为观察强荧光提供了一种更便宜的替代方案，例如在 DNA 分析中。

有多种风冷和固态激光器可供选择。最常见的初级激光器是风冷氩离子激光器，可产生 488 nm 的蓝光。该波长便于激发荧光素，这是第一个使用的免疫荧光标记。一般使用的其他风冷激光器包括 He-Ne (633 nm) 和 He-CD (325 nm)。

可使用产生 355、405、488、530、594、635 和 780 nm 光的固态激光器。大多数固态激光器产生的功率在 10 到 25 mW 之间。至少有一个二极管激光器在 488 nm 处提供 200 mW。

虽然更高的功率输出提高了灵敏度，但在增加成本、维护和尺寸方面需要付出代价。一些专业应用需要更高的激光功率，例如染色体分析和分选，并使用产生 200 mW 或更高功率的水冷激光器。

2.4 光学

2.4.1 典型安排

流式细胞仪的主要光学元件 如图 2.7 所示。这显示了一种简单仪器的可能布局，该仪器适用于测量用荧光素、藻红蛋白 (PE) 和 PE-菁5 偶联物标记的抗体孵育的细胞的免疫荧光。

光源是通过聚焦透镜的蓝色氩离子激光。在流动室的另一侧是一个阻挡激光束的杆。前向散射检测器位于阻挡条的后面，检测向前方向以小角度散射的光。收集透镜与激光束成直角放置。一系列分色镜（有时称为分束器）选择不同波长的光。

图 2.7。 一个简单的流式细胞仪的布局。文中给出了详细的解释。

表 2.1。 滤光片的特性 如图 2.7所示。LWP = 长传

请注意，收集透镜的设计目的是产生无限远聚焦的光（准直光束），因此光电倍增管 (PMT) 可以放置在距流动室的任何距离处。或者，可以将光聚焦在每个 PMT 前面的针孔上，以减少收集到的不需要的光量。在这种情况下，PMT 必须与流动室等距（就光路而言），因此需要不同的布局。

过滤器的属性在 表 2.1中列出。第一个分色镜选择波长小于 500 nm（蓝色）的光。在通过选择蓝光（475-495 nm）的屏障滤光片后，光落在第一个 PMT（侧向散射，SS）上。第二个分色镜选择 540 nm 以下的光，通过绿色屏障滤光片到达 PMT 2。第三个分色镜选择低于 590 nm 的光，通过橙色滤光片到达 PMT 3，最后剩余的光在通过红色滤光片后落在 PMT 4筛选。     

2.4.2 先进的光学布局

图 2.8 显示了“最先进”细胞仪的光学布局。该仪器是 Dako-Cytomation Mo-Flo，配置在加州大学戴维斯分校兽医学院。它具有三个激光器，分别发出蓝色、红色和紫外线。来自蓝色（氩激光）的光被引导到左侧，测量侧向散射和 5 个荧光。在右侧，记录了来自红色 (He-Ne) 激光的四种颜色。另一个站测量来自固态紫激光的两个荧光。

图 2.8。 用于测量 12 种颜色的光学布局 - 一种散射和 11 种荧光。图片经加州大学戴维斯分校 Nicole Baumgarth 博士许可转载。正文中给出了详细信息。

2.4.3 聚焦激光束

光束必须聚焦在样品流上。这可以通过一个简单的透镜来实现，该透镜的光束横截面通常约为 50 µm。一些仪器使用椭圆透镜产生 20 x 60 µm 椭圆光束。另一种配置是一对交叉柱面透镜，它可以从直径为 1 mm 的激光束中产生通常为 5 x 120 µm 的椭圆光斑（图 2.9）。可以通过选择合适的透镜对来指定所需的激光束轮廓。

图 2.9。 用于聚焦的交叉柱面透镜对。

球形或近球形光束与气流系统一起使用，其中光束的直径必须小于气流的直径，以最大限度地减少气流-空气界面的过度光散射。该系统中细胞的更高速度提供了可接受的快速信号脉冲（2-7 µs）和宽激光束。整个细胞在通过光束时被照亮，并且由于存在遮光条（用于阻挡从流/空气界面反射的大部分光）而导致的荧光损失通过更有效的激发得到部分补偿的细胞。

宽而平的光束与基于石英腔的流动腔一起使用，其更有效的收集光学器件补偿了细胞的较低照明水平。小光束高度还可以从移动较慢的细胞中产生快速电子脉冲（~5 µs）。

椭圆形光束的优点是当它穿过光束时，细胞被更均匀地照亮（图 2.10）。一些关于细胞形状的信息也可用于 DNA 分析（第 4 章）。

图 2.10。 光束形状对同轴（相对于离轴）单元所看到的光的激光束强度的影响。光束中细胞的精确定位对于更平坦的光束来说不太重要。

2.4.4 落射照明

在基于荧光显微镜的仪器中，激发光束（通常来自弧光灯）和发射的荧光通过同一个透镜收集（反射）。

2.4.5 光采集

收集透镜应具有尽可能高的数值孔径，以收集尽可能多的荧光。在分析仪中，与细胞分选器相比，比色皿流通池可以使用更短的工作距离，包括浸没物镜，从而获得更高的数值孔径。

在使用气流系统的细胞分选机中，透镜的工作距离明显受到限制。在采用石英比色皿的细胞分选仪中，由于需要振动流通池（参见 第 2.7 节） ， 因此无法使用浸没物镜。但是，在这种情况下，可以通过将小透镜粘合到流通池的侧面来改善光收集。

2.4.6 滤光片

激光发射单一波长的光，而弧光灯发射宽光谱。因此，弧光灯需要滤光片来选择正确的激发波长。这些通常由有色玻璃制成。激光不需要进一步过滤。输出侧使用的二向色和带通滤光片通常是干涉滤光片。

带通滤光片在窄带上传输光，通常直接在检测器前面使用。它们的重要参数是透射的峰值波长、在峰值波长处透射的光的百分比和它们的带宽（以 50% 透射点的间隔测量）（图 2.11）。

二向色滤光片（有时称为分束器）在流式细胞仪中使用的角度通常为 45°。短波通 (SWP) 滤光片传输低于给定波长的光并反射更长波长的光。长波通 (LWP) 滤光片以相反的方式工作。它们的重要参数是 50% 透射的波长（LWP 的截止波长或 SWP 的截止波长）、峰值透射率和截止波长或截止波长处的斜率。它们的特性取决于使用它们的角度。

图 2.11。 流式细胞术中使用的两种滤光片的特性说明。 

2.5 探测器

固态检测器足以测量前向散射光。为了测量与激光束成直角的荧光和散射，使用光电倍增管。PMT 的灵敏度取决于光的波长。对于用于检测 600 nm 及以上波长的位置，选择对红色敏感的 PMT。

2.6 信号处理

以下部分描述了电子设备如何处理来自检测器的信号。直到最近，大多数仪器都使用传统的电子电路。在更现代的机器中，信号在早期从模拟转换为数字，所有后续处理都以数字方式处理。数字处理有几个优点，尤其是准确性和速度。电子元件的主要元件 如图 2.12所示。

图 2.12。 流式细胞仪的主要电子元件。ADC = 模数转换器。

2.6.1 电子触发器

在（预）放大之后，来自光电倍增管的信号经过进一步处理。仪器必须设置为响应来自感兴趣粒子（例如细胞）的信号，并忽略来自电子噪声的碎片和“尖峰”。在一个或可能两个参数上设置阈值水平，使得仅当信号上升到高于该水平时才检测到细胞。所选参数有时称为鉴别器。通常使用光散射作为触发器。仪器可能会根据 DNA 荧光染色的信号触发，但通常不应使用免疫荧光信号，因为可能会无意中将阴性细胞排除在分析之外。

正确设置鉴别器很重要。不正确的设置将阻止正确记录信号（图 2.13）。

图 2.13。更改鉴别器设置的效果。显示来自人外周血白细胞的侧向与前向光散射。鉴别器已设置为前向光散射。A. 鉴别器设置得太低，无法记录残留的红细胞和碎片。B. 判别器设置正确。C. 判别器设置太高。一些较小的细胞丢失。 数据文件

2.6.2 脉冲处理

当细胞通过激光束时，会产生一个信号脉冲，该脉冲具有高度（或峰值）、宽度和积分面积（图 2.14）。如果激光束的宽度大于细胞直径，信号的峰值（或高度）将准确反映细胞的总荧光。由于这样更快更容易记录，因此通常会记录此参数。如果使用窄的椭圆形光束，则在任何给定时间只能照亮细胞的一部分。为了产生与细胞总荧光成比例的信号，需要对脉冲进行积分（脉冲面积）。脉冲的宽度和峰值也可以被记录下来，这将提供一些关于通过光束的细胞长度的信息。该信息可用于 DNA 测量，以区分单细胞或细胞核和双联体（参见 第 4 章）。

来自前向光散射的脉冲宽度有时用于测量细胞通过激光束的“飞行时间”，从而测量其长度。

图 2.14。 当细胞通过激光束时产生的信号。

2.6.3 线性或对数数据显示

大多数细胞仪提供荧光和光散射强度的线性和对数显示之间的选择。

对于细胞周期测量，使用 DNA 染色剂，应始终使用线性扩增。对于免疫荧光，对数放大调节信号，使得弱信号和强信号都可以以相同的比例记录。更改为对数显示具有压缩积极事件的比例并扩大消极事件的比例的效果。结果，通过眼睛，观察者对正面和负面事件之间的比率有更好的印象。当然，实际数字是相同的。

图 2.15 显示了使用荧光素标记的 CD8 抗体获得的人淋巴细胞数据。请注意，使用线性比例时，负面事件很难在 y 轴上。必须缩小 y 轴的比例以观察积极事件。一些积极的事件太亮而无法在 x 轴上容纳并且超出比例。

图 2.15。 CD8在人淋巴细胞上的表达。使用线性和对数放大记录数据。 数据文件

2.7 细胞分选

2.7.1 简介

有两种使用流式细胞仪分选细胞的方法。最常见的方法是通过带电液滴的静电偏转。替代方法使用压电装置对细胞进行机械分类。

2.7.2 带电液滴偏转分选

使用导电鞘液（缓冲盐水）。流动室通过压电换能器以通常在 20 和 60 kHz kHz 之间的频率垂直振动。这种振动会导致从出口喷嘴流出的流体（通常直径为 75 µm）分解成液滴。当感兴趣的细胞位于当前形成的液滴内时，流动室以及因此的流动流被充电（± v，其中 v 通常位于 50 和 150 V 之间）。液滴流通过一对带电板（± 5000 V），使带电液滴偏转并与其中包含的电池一起收集（图 2.16）。因此，可以使用 +ve 或 -ve 电荷对任意两个预定义门中的单元进行分类。

当细胞通过激光束时，决定是否对细胞进行分类。为确保流动室在正确的时刻充电，必须确定细胞通过激光束和液滴断裂点之间的时间延迟，并将其输入计算机进行分类决定。任何影响分离点位置的因素（温度变化、气流、流通池孔中的污垢）都会对分选机的稳定性产生不利影响。为每个分选的细胞偏转和收集一个以上的液滴将最大限度地减少分选条件微小变化的影响。

偏转的液滴中偶尔会有不止一个细胞。电子电路可以检测到这些巧合，如果需要高纯度（以稍低的产量为代价），则可以中止分类决定。

图 2.16。 通过液滴偏转对细胞进行分类。

在理想条件下，细胞可以以 98% 或更高的纯度进行分选。虽然纯度很高，但与许多其他细胞分离方法相比，产率较低。

假设流速为 5000 个细胞 s ^-1，如果要分选的亚群的浓度为 10%，并允许通过拒绝巧合而造成一些损失，则收集的最大细胞数约为 2.10 ⁶  h ^-1。

分选率取决于种群中所需细胞的百分比、测量细胞的速率和液滴频率。“空气流”分选机将具有更高的分选率，因为细胞具有更高的流速。比色皿系统中较慢的流速可以通过使用窄腰激光束和在流动室内引入收缩来抵消。

可以减小液滴尺寸，因此通过减小流动室孔口的直径可以增加液滴形成频率（以及在“空气中流”配置中的流速）。孔口的最小尺寸由被分类的细胞的大小决定。还可以通过增加样品压力来增加流速。

有专门为高速细胞分选而设计的商业仪器（Dako Cytomation MoFlo，BD Aria）。^{它们可以实现高达 70,000 个细胞 s -1}的最大流速。通过在充电脉冲上使用两种不同的电压，他们还可以对四个群体进行分类（每边两个）

2.7.3 机械分选细胞

在一些分选机中，通过使用压电装置将细胞偏离主流来实现所需群体的分离。例如，在 Partec PAS III 机器中，压电流体阀在 Y 形流道的一个臂上运行，待收集的细胞沿 Y 形流道的一个臂向下偏转。这种分选机可用于分选大颗粒，例如原生质体，因为它避免了静电分选机中精确液滴形成所需的尺寸限制。

压电电池分选机的优势在于，一旦设置好，它们就非常稳定。它们不需要校准或调整 - 只需打开即可。他们有缺点。因为它们是机械操作，它们被限制为最多分选 300 个细胞 s ^-1 并且收集容器接收恒定的鞘液流，稀释分选的细胞。只能对单个细胞群进行排序。

2.8 测量仪器性能

流式细胞仪的性能通过其灵敏度来判断，灵敏度可以从荧光阈值或分辨率来定义（Wood 和 Hoffman，1998 年）。荧光阈值是可以与背景区分开来的荧光粒子的最低信号；分辨率是仪器可以区分混合物中非荧光和微弱荧光群体的程度。

灵敏度将取决于光收集效率、电子放大器的增益和背景噪声。噪声有两个元素 - 电子噪声和落在光检测器上的外来光（例如，不被滤光片排除的散射光）。这些因素是仪器光学和电子元件设计的函数。

可以购买成套校准的荧光珠，包括非荧光珠。使用对数放大记录珠子的荧光，并根据等效可溶性荧光染料分子 (MESF)（参见 第 5 章第 5.3 节）对通道数的图估计灵敏度。

仪器的一般性能应每天使用标准珠、荧光和非荧光检查。对于给定的激光功率，应记录固定放大器设置下荧光直方图中珠子的通道数。如果荧光珠的通道数减少或非荧光珠的通道数增加，则应检查流通池的清洁度和仪器的对齐情况。这些程序应构成流式细胞仪实验室中任何质量控制过程的一部分。